BDDE क्रस-लिंक गरिएको अटोक्लेभमा नयाँ प्रतिक्रिया उप-उत्पादनहरूको पत्ता लगाउने

जाभास्क्रिप्ट हाल तपाईको ब्राउजरमा असक्षम गरिएको छ।जब जाभास्क्रिप्ट असक्षम हुन्छ, यस वेबसाइटका केही प्रकार्यहरूले काम गर्ने छैनन्।
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgenia Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * यी लेखकहरूसँग यस कार्यमा केही अन्तरदृष्टि छन्। योगदान पृष्ठभूमि: Hyaluronic एसिड (HA) सौन्दर्य उद्देश्यका लागि डर्मल फिलरको उत्पादनमा प्रयोग हुने प्राकृतिक रूपमा हुने पोलिसैकराइड हो।मानव तन्तुहरूमा धेरै दिनको आधा-जीवन भएकोले, HA- आधारित डर्मल फिलरहरू शरीरमा आफ्नो जीवन विस्तार गर्न रासायनिक रूपमा परिमार्जन गरिन्छ।व्यावसायिक HA-आधारित फिलरहरूमा सबैभन्दा सामान्य परिमार्जन 1,4-butanediol diglycidyl ईथर (BDDE) को क्रसलिङ्किङ एजेन्टको रूपमा HA चेनहरूलाई क्रसलिङ्क गर्न प्रयोग गर्नु हो।अवशिष्ट वा प्रतिक्रिया नगरिएको BDDE <2 भाग प्रति मिलियन (ppm) मा गैर-विषाक्त मानिन्छ;तसर्थ, अन्तिम डर्मल फिलरमा रहेको अवशिष्ट BDDE बिरामीको सुरक्षा सुनिश्चित गर्न परिमाणित हुनुपर्छ।सामग्री र विधिहरू: यस अध्ययनले तरल क्रोमेटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) को संयोजन गरेर क्षारीय अवस्थाहरूमा BDDE र HA बीचको क्रस-लिङ्किङ प्रतिक्रियाको उप-उत्पादनको पहिचान र विशेषता वर्णन गर्दछ।परिणामहरू: विभिन्न विश्लेषणहरू पछि, यो फेला पर्यो कि HA-BDDE हाइड्रोजेललाई कीटाणुरहित गर्न प्रयोग गरिने क्षारीय अवस्था र उच्च तापक्रमले यो नयाँ उप-उत्पादन, "प्रोपाइलिन ग्लाइकोल-जस्तो" कम्पाउन्डको गठनलाई बढावा दियो।LC-MS विश्लेषणले पुष्टि गर्‍यो कि उप-उत्पादनमा BDDE, फरक अवधारण समय (tR), र फरक UV अवशोषण (λ=200 nm) मोडको रूपमा उही मोनोइसोटोपिक मास छ।BDDE को विपरीत, यो LC-MS विश्लेषणमा देखियो कि उही मापन अवस्थाहरूमा, यस उप-उत्पादनको 200 nm मा उच्च पत्ता लगाउने दर छ।निष्कर्ष: यी परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि यस नयाँ यौगिकको संरचनामा कुनै इपक्साइड छैन।व्यापारिक उद्देश्यका लागि HA-BDDE हाइड्रोजेल (HA डर्मल फिलर) को उत्पादनमा पाइने यस नयाँ उप-उत्पादनको जोखिम मूल्याङ्कन गर्न छलफल खुला छ।कीवर्डहरू: hyaluronic एसिड, HA डर्मल फिलर, क्रस-लिंक गरिएको hyaluronic एसिड, BDDE, LC-MS विश्लेषण, BDDE उप-उत्पादन।
hyaluronic एसिड (HA) मा आधारित फिलरहरू कस्मेटिक उद्देश्यका लागि प्रयोग हुने सबैभन्दा सामान्य र लोकप्रिय डर्मल फिलरहरू हुन्।1 यो डर्मल फिलर एक हाइड्रोजेल हो, सामान्यतया > 95% पानी र 0.5-3% HA मिलेर बनेको हुन्छ, जसले तिनीहरूलाई जेल जस्तो संरचना दिन्छ।2 HA एक polysaccharide र कशेरुकाहरूको बाह्य कोशिका म्याट्रिक्सको मुख्य घटक हो।सामग्री मध्ये एक।यसमा (1,4)-glucuronic acid-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) दोहोरिने डिसैकराइड एकाइहरू ग्लाइकोसिडिक बन्डद्वारा जोडिएको हुन्छ।यो disaccharide ढाँचा सबै जीवहरूमा समान छ।केही प्रोटिन-आधारित फिलरहरू (जस्तै कोलाजेन) सँग तुलना गर्दा, यो गुणले HA लाई अत्यधिक बायोकम्प्याटिबल अणु बनाउँछ।यी फिलरहरूले एमिनो एसिड अनुक्रम विशिष्टता प्रदर्शन गर्न सक्छन् जुन बिरामीको प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा पहिचान हुन सक्छ।
डर्मल फिलरको रूपमा प्रयोग गर्दा, HA को मुख्य सीमितता हाइलुरोनिडासेस भनिने इन्जाइमहरूको विशिष्ट परिवारको उपस्थितिको कारण टिश्युहरू भित्र यसको द्रुत कारोबार हो।अहिलेसम्म, HA संरचनामा धेरै रासायनिक परिमार्जनहरू ऊतकहरूमा HA को आधा-जीवन बढाउन वर्णन गरिएको छ।3 यी धेरै परिमार्जनहरूले HA चेनहरू क्रस-लिंक गरेर हाइलुरोनिडेजको पोलिसेकराइड पोलिमरहरूमा पहुँच कम गर्ने प्रयास गर्छन्।त्यसकारण, HA संरचना र क्रस-लिङ्किङ एजेन्ट बीच पुलहरू र अन्तरआणविक सहसंयोजक बन्धनको गठनको कारण, क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेलले प्राकृतिक HA भन्दा बढी एन्जाइम डिग्रेडेसन उत्पादनहरू उत्पादन गर्दछ।४-६
अहिलेसम्म, क्रसलिङ्क गरिएको HA उत्पादन गर्न प्रयोग गरिने रासायनिक क्रसलिङ्किङ एजेन्टहरूमा मेथाक्रिलामाइड, ७ हाइड्राजाइड, ८ कार्बोडाइमाइड, ९ डिभिनाइल सल्फोन, १,४-ब्युटानेडियोल डिग्लिसिडिल ईथर (बीडीडीई) र पोली (इथिलीन ग्लाइकोल) डाइग्लिसिडिल ईथर समावेश छन्।10,11 BDDE हाल सबैभन्दा बढी प्रयोग हुने क्रसलिङ्किङ एजेन्ट हो।यद्यपि यी प्रकारका हाइड्रोजेलहरू दशकौंको लागि सुरक्षित साबित भएका छन्, प्रयोग गरिएका क्रसलिङ्किङ एजेन्टहरू प्रतिक्रियाशील अभिकर्मकहरू हुन् जुन साइटोटोक्सिक हुन सक्छ र, केही अवस्थामा, म्युटेजेनिक।12 त्यसकारण, अन्तिम हाइड्रोजेलमा तिनीहरूको अवशिष्ट सामग्री उच्च हुनुपर्छ।BDDE सुरक्षित मानिन्छ जब अवशिष्ट एकाग्रता 2 भाग प्रति मिलियन (ppm) भन्दा कम हुन्छ।४
HA हाइड्रोजेलमा कम-अवशेष BDDE एकाग्रता, क्रस-लिङ्किङ डिग्री र प्रतिस्थापन स्थिति पत्ता लगाउन धेरै तरिकाहरू छन्, जस्तै ग्यास क्रोमाटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), आणविक चुम्बकीय अनुनाद (NMR) प्रतिदीप्ति मापन विधिहरू, र ग्यास क्रोमाटोग्राफी। डायोड एरे युग्मित उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC)।13-17 यस अध्ययनले क्षारीय अवस्थाहरूमा BDDE र HA को प्रतिक्रियाद्वारा उत्पादित अन्तिम क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेलमा उप-उत्पादनको पहिचान र विशेषता वर्णन गर्दछ।HPLC र तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS विश्लेषण)।BDDE को यस उप-उत्पादनको विषाक्तता अज्ञात हुनाले, हामी सिफारिस गर्छौं कि यसको अवशेष परिमाण निर्धारण सामान्यतया अन्तिम उत्पादनमा BDDE मा गरिने विधि जस्तै गरी निर्धारण गरिनुपर्छ।
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) को प्राप्त सोडियम नुनको आणविक तौल ~ 1,368,000 Da (Laurent method) 18 र भित्री चिपचिपाहट 2.20 m3/kg छ।क्रसलिङ्किङ प्रतिक्रियाको लागि, BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) बाट खरिद गरिएको थियो।PH 7.4 भएको फस्फेट बफर गरिएको सलाइन सिग्मा-एल्ड्रिच कम्पनीबाट खरिद गरिएको थियो।LC-MS विश्लेषणमा प्रयोग गरिएका सबै सॉल्भेन्ट्स, एसिटोनिट्रिल र पानी HPLC ग्रेड गुणस्तरबाट खरिद गरिएको थियो।Formic एसिड (98%) अभिकर्मक ग्रेड रूपमा खरिद गरिएको छ।
सबै प्रयोगहरू UPLC एक्विटी प्रणाली (Waters, Milford, MA, USA) मा गरिएको थियो र Electrospray ionization स्रोत (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) संग सुसज्जित API 3000 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमिटरमा जडान गरिएको थियो।
क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेलको संश्लेषण 1% अल्काली (सोडियम हाइड्रोक्साइड, NaOH) को उपस्थितिमा 10% (w/w) सोडियम hyaluronate (NaHA) समाधानमा 198 mg BDDE थपेर सुरु गरिएको थियो।प्रतिक्रिया मिश्रणमा अन्तिम BDDE एकाग्रता 9.9 mg/mL (0.049 mM) थियो।त्यसपछि, प्रतिक्रिया मिश्रण राम्ररी मिश्रित र एकरूप थियो र 4 घण्टाको लागि 45 डिग्री सेल्सियसमा अगाडि बढ्न अनुमति दिइएको थियो।19 प्रतिक्रियाको pH ~12 मा राखिएको छ।
त्यसपछि, प्रतिक्रिया मिश्रणलाई पानीले धोइयो, र अन्तिम HA-BDDE हाइड्रोजेललाई 10 देखि 25 mg/mL को HA एकाग्रता, र 7.4 को अन्तिम pH प्राप्त गर्न PBS बफरसँग फिल्टर र पातलो गरियो।उत्पादित क्रस-लिङ्क गरिएको HA हाइड्रोजेलहरूलाई बाँझ बनाउनको लागि, यी सबै हाइड्रोजेलहरू अटोक्लेभ हुन्छन् (२० मिनेटको लागि 120 डिग्री सेल्सियस)।शुद्ध BDDE-HA हाइड्रोजेल विश्लेषण नभएसम्म 4°C मा भण्डारण गरिन्छ।
क्रस-लिङ्क गरिएको HA उत्पादनमा रहेको BDDE को विश्लेषण गर्न, 240 mg नमूना तौल गरी सेन्टर होल (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; भोल्युम 0.5 mL) मा प्रस्तुत गरियो र कोठाको तापमानमा 10,000 rpm मा सेन्ट्रीफ्युज गरियो। १० मिनेट।कुल 20 μL पुल-डाउन तरल सङ्कलन र विश्लेषण गरिएको थियो।
BDDE मानक (Sigma-Aldrich Co) को क्षारीय अवस्था (1%, 0.1% र 0.01% NaOH) अन्तर्गत विश्लेषण गर्न, यदि निम्न सर्तहरू पूरा भएमा, तरल नमूना 1:10, 1:100, वा माथि छ। 1:1,000,000 आवश्यक भएमा, विश्लेषणको लागि MilliQ deionized पानी प्रयोग गर्नुहोस्।
क्रस-लिङ्किङ प्रतिक्रिया (HA 2%, H2O, 1% NaOH, र 0.049 mM BDDE) मा प्रयोग गरिएको प्रारम्भिक सामग्रीहरूको लागि, यी सामग्रीहरूबाट तयार गरिएको प्रत्येक नमूनाको 1 एमएल एउटै विश्लेषण अवस्थाहरू प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।
आयन नक्सामा देखिने चुचुराहरूको विशिष्टता निर्धारण गर्न, 10 µL 100 ppb BDDE मानक समाधान (Sigma-Aldrich Co) लाई 20 µL नमूनामा थपियो।यस अवस्थामा, प्रत्येक नमूनामा मानकको अन्तिम एकाग्रता 37 ppb हो।
पहिले, मानक BDDE (Sigma-Aldrich Co) को 10 μL 990 μL MilliQ पानी (घनत्व 1.1 g/mL) मा पातलो गरी 11,000 mg/L (11,000 ppm) को एकाग्रताको साथ BDDE स्टक समाधान तयार गर्नुहोस्।मध्यवर्ती मानक कमजोरीको रूपमा 110 µg/L (110 ppb) BDDE समाधान तयार गर्न यो समाधान प्रयोग गर्नुहोस्।त्यसपछि, 75, 50, 25, 10, र 1 ppb को इच्छित एकाग्रता प्राप्त गर्न मध्यवर्ती पातलो धेरै पटक पातलो गरेर मानक वक्र तयार गर्न मध्यवर्ती BDDE मानक पातलो (110 ppb) प्रयोग गर्नुहोस्।चित्र 1 मा देखाइए अनुसार, 1.1 देखि 110 ppb सम्मको BDDE मानक वक्र राम्रो रेखीयता (R2> 0.99) छ।मानक वक्र चार स्वतन्त्र प्रयोगहरूमा दोहोर्याइएको थियो।
चित्र 1 BDDE मानक क्यालिब्रेसन वक्र LC-MS विश्लेषण द्वारा प्राप्त, जसमा राम्रो सम्बन्ध अवलोकन गरिएको छ (R2>0.99)।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री।
आधार समाधानमा क्रस-लिङ्क गरिएको HA र BDDE मापदण्डहरूमा अवस्थित BDDE मापदण्डहरू पहिचान गर्न र मात्रा निर्धारण गर्न, LC-MS विश्लेषण प्रयोग गरिएको थियो।
क्रोमेटोग्राफिक विभाजन LUNA 2.5 µm C18(2)-HST स्तम्भ (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) मा हासिल गरिएको थियो र विश्लेषणको क्रममा कोठाको तापमान (25°C) मा राखिएको थियो।मोबाइल फेजमा एसिटोनिट्रिल (सल्भेन्ट ए) र पानी (सल्भेन्ट बी) ०.१% फॉर्मिक एसिड हुन्छ।मोबाइल चरण ग्रेडियन्ट इल्युसन द्वारा इल्युट गरिएको छ।ग्रेडियन्ट निम्नानुसार छ: 0 मिनेट, 2% ए;1 मिनेट, 2% A;६ मिनेट, ९८% ए;७ मिनेट, ९८% ए;7.1 मिनेट, 2% A;10 मिनेट, 2% A। चलिरहेको समय 10 मिनेट हो र इंजेक्शन भोल्युम 20 μL हो।BDDE को अवधारण समय लगभग 3.48 मिनेट हो (प्रयोगहरूमा आधारित 3.43 देखि 4.14 मिनेट सम्म)।मोबाइल चरण LC-MS विश्लेषणको लागि 0.25 mL/min को प्रवाह दरमा पम्प गरिएको थियो।
BDDE विश्लेषण र MS द्वारा परिमाणीकरणको लागि, UPLC प्रणाली (पानी) लाई एपीआई 3000 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमिटर (AB SCIEX) सँग जोडिएको छ जसमा इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत छ, र विश्लेषण सकारात्मक आयन मोड (ESI+) मा गरिन्छ।
BDDE मा प्रदर्शन गरिएको आयन टुक्रा विश्लेषण अनुसार, उच्चतम तीव्रता भएको टुक्रा 129.1 Da (चित्र 6) सँग सम्बन्धित टुक्रा हुन निर्धारण गरिएको थियो।तसर्थ, परिमाणीकरणको लागि बहु-आयन निगरानी मोड (MIM) मा, BDDE को मास रूपान्तरण (मास-टू-चार्ज अनुपात [m/z]) 203.3/129.1 Da हो।यसले LC-MS विश्लेषणको लागि पूर्ण स्क्यान (FS) मोड र उत्पादन आयन स्क्यान (PIS) मोड पनि प्रयोग गर्दछ।
विधिको विशिष्टता प्रमाणित गर्नको लागि, खाली नमूना (प्रारम्भिक मोबाइल चरण) विश्लेषण गरिएको थियो।203.3/129.1 Da को सामूहिक रूपान्तरणको साथ खाली नमूनामा कुनै संकेत फेला परेन।प्रयोगको पुनरावृत्तिको सन्दर्भमा, 55 ppb (क्यालिब्रेसन वक्रको बीचमा) को 10 मानक इंजेक्शनहरू विश्लेषण गरियो, परिणामस्वरूप अवशिष्ट मानक विचलन (RSD) <5% (डेटा देखाइएको छैन)।
अवशिष्ट BDDE सामग्री आठ अलग-अलग अटोक्लेभ गरिएको BDDE क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेलहरूमा परिमाण गरिएको थियो, चार स्वतन्त्र प्रयोगहरूसँग सम्बन्धित।"सामग्री र विधिहरू" खण्डमा वर्णन गरिए अनुसार, परिमाणीकरण BDDE मानक कमजोरीको रिग्रेसन कर्भको औसत मानद्वारा मूल्याङ्कन गरिन्छ, जुन 203.3/129.1 Da को BDDE मास ट्रान्जिसनमा पत्ता लागेको अद्वितीय शिखरसँग मेल खान्छ, एक अवधारणको साथ। समय 3.43 देखि 4.14 मिनेट पर्खिरहेको छैन।चित्र 2 ले 10 ppb BDDE सन्दर्भ मानकको उदाहरण क्रोमेटोग्राम देखाउँछ।तालिका 1 ले आठ विभिन्न हाइड्रोजेलहरूको अवशिष्ट BDDE सामग्रीलाई सारांशित गर्दछ।मान दायरा 1 देखि 2.46 ppb सम्म छ।त्यसकारण, नमूनामा अवशिष्ट BDDE एकाग्रता मानव प्रयोगको लागि स्वीकार्य छ (<2 ppm)।
चित्र 2 को 10 ppb BDDE सन्दर्भ मानक (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) संक्रमण 203.30/129.10 Da को LC-MS विश्लेषण द्वारा प्राप्त (सकारात्मक MRM मोडमा) को आयन क्रोमेटोग्राम।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी;एमएस, मास;m/z, मास-टू-चार्ज अनुपात।
नोट: नमूनाहरू 1-8 अटोक्लेभ गरिएको BDDE क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेलहरू हुन्।हाइड्रोजेलमा BDDE को अवशिष्ट मात्रा र BDDE अवधारण समयको शिखर पनि रिपोर्ट गरिएको छ।अन्तमा, बिभिन्न अवधारण समयका साथ नयाँ चुचुराहरूको अस्तित्व पनि रिपोर्ट गरिएको छ।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;HA, hyaluronic एसिड;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी;tR, अवधारण समय;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;RRT, सापेक्ष अवधारण समय।
अचम्मको कुरा, LC-MS आयन क्रोमेटोग्रामको विश्लेषणले देखाएको छ कि विश्लेषण गरिएका सबै अटोक्लेभ क्रस-लिंक गरिएका HA हाइड्रोजेल नमूनाहरूमा आधारित, 2.73 देखि 3.29 मिनेटको छोटो अवधारण समयमा अतिरिक्त शिखर थियो।उदाहरणका लागि, चित्र 3 ले क्रस-लिङ्क गरिएको HA नमूनाको आयन क्रोमेटोग्राम देखाउँछ, जहाँ एक अतिरिक्त शिखर लगभग 2.71 मिनेटको फरक अवधारण समयमा देखिन्छ।BDDE बाट भर्खरै अवलोकन गरिएको शिखर र शिखर बीचको अवलोकन गरिएको सापेक्ष अवधारण समय (RRT) 0.79 (तालिका 1) फेला पर्यो।हामीलाई थाहा छ कि LC-MS विश्लेषणमा प्रयोग गरिएको C18 स्तम्भमा भर्खरै अवलोकन गरिएको शिखर कम राखिएको छ, नयाँ चोटी BDDE भन्दा बढी ध्रुवीय यौगिकसँग मेल खान्छ।
चित्र 3 LC-MS (MRM मास रूपान्तरण 203.3/129.0 Da) द्वारा प्राप्त क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेल नमूनाको आयन क्रोमेटोग्राम।
संक्षिप्त रूप: HA, hyaluronic एसिड;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी;RRT, सापेक्ष अवधारण समय;tR, अवधारण समय।
अवलोकन गरिएको नयाँ चुचुराहरू प्रयोग गरिएका कच्चा पदार्थहरूमा मूल रूपमा अवस्थित प्रदूषकहरू हुन सक्ने सम्भावनालाई अस्वीकार गर्न, यी कच्चा पदार्थहरूलाई पनि LC-MS विश्लेषण विधि प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।विश्लेषण गरिएको प्रारम्भिक सामग्रीहरूमा पानी, 2% NaHA पानीमा, 1% NaOH पानीमा, र क्रस-लिङ्किङ प्रतिक्रियामा प्रयोग गरिएको समान एकाग्रतामा BDDE समावेश छ।प्रयोग गरिएको प्रारम्भिक सामग्रीको आयन क्रोमेटोग्रामले कुनै कम्पाउन्ड वा शिखर देखाउँदैन, र यसको अवधारण समय अवलोकन गरिएको नयाँ शिखरसँग मेल खान्छ।यो तथ्यले यो विचारलाई खारेज गर्छ कि केवल प्रारम्भिक सामग्रीमा कुनै पनि यौगिकहरू वा पदार्थहरू समावेश हुन सक्छन् जसले विश्लेषण प्रक्रियामा हस्तक्षेप गर्न सक्छ, तर अन्य प्रयोगशाला उत्पादनहरूसँग सम्भावित क्रस-प्रदूषणको कुनै संकेत छैन।BDDE र नयाँ शिखरहरूको LC-MS विश्लेषण पछि प्राप्त एकाग्रता मानहरू तालिका 2 (नमूना 1-4) र चित्र 4 मा आयन क्रोमेटोग्राममा देखाइएको छ।
नोट: नमूनाहरू 1-4 अटोक्लेभ गरिएको BDDE क्रस-लिंक गरिएको HA हाइड्रोजेलहरू उत्पादन गर्न प्रयोग गरिने कच्चा मालसँग मेल खान्छ।यी नमूनाहरू अटोक्लेभ गरिएका थिएनन्।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;HA, hyaluronic एसिड;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी।
चित्र 4 HA र BDDE को क्रस-लिङ्किङ प्रतिक्रियामा प्रयोग गरिएको कच्चा मालको नमूनाको LC-MS क्रोमेटोग्रामसँग मेल खान्छ।
नोट: यी सबै क्रस-लिङ्किङ प्रतिक्रिया गर्न प्रयोग गरिने समान एकाग्रता र अनुपातमा मापन गरिन्छ।क्रोमेटोग्रामद्वारा विश्लेषण गरिएका कच्चा पदार्थहरूको संख्याहरू निम्नसँग मेल खान्छ: (1) पानी, (2) 2% HA जलीय घोल, (3) 1% NaOH जलीय घोल।LC-MS विश्लेषण 203.30/129.10 Da (सकारात्मक MRM मोडमा) को सामूहिक रूपान्तरणको लागि गरिन्छ।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;HA, hyaluronic एसिड;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी।
नयाँ चुचुराहरूको गठनको नेतृत्व गर्ने अवस्थाहरू अध्ययन गरियो।क्रस-लिङ्क गरिएको HA हाइड्रोजेल उत्पादन गर्न प्रयोग गरिएका प्रतिक्रिया अवस्थाहरूले BDDE क्रस-लिङ्किङ एजेन्टको प्रतिक्रियालाई कसरी असर गर्छ भन्ने अध्ययन गर्न, नयाँ शिखरहरू (सम्भव उप-उत्पादनहरू) को गठनमा नेतृत्व गर्दछ, विभिन्न मापनहरू प्रदर्शन गरियो।यी निर्धारणहरूमा, हामीले अन्तिम BDDE क्रसलिङ्करको अध्ययन र विश्लेषण गर्‍यौं, जसलाई जलीय माध्यममा NaOH (0%, 1%, 0.1%, र 0.01%) को विभिन्न सांद्रताहरूसँग व्यवहार गरिएको थियो, पछि वा अटोक्लेभिङ बिना।समान अवस्थाहरू अनुकरण गर्न ब्याक्टेरिया प्रक्रिया क्रस-लिङ्क गरिएको HA हाइड्रोजेल उत्पादन गर्न प्रयोग गरिएको विधि जस्तै हो।"सामग्री र विधिहरू" खण्डमा वर्णन गरिए अनुसार, नमूनाको सामूहिक संक्रमण LC-MS द्वारा 203.30/129.10 Da मा विश्लेषण गरिएको थियो।BDDE र नयाँ शिखरको एकाग्रता गणना गरिएको छ, र परिणामहरू तालिका 3 मा देखाइएको छ। समाधानमा NaOH को उपस्थितिलाई ध्यान दिए बिना, स्वत: क्लव नगरिएका नमूनाहरूमा कुनै नयाँ शिखरहरू फेला परेनन् (नमूनाहरू 1-4, तालिका ३)अटोक्लेभ गरिएको नमूनाहरूको लागि, समाधानमा NaOH को उपस्थितिमा मात्र नयाँ चुचुराहरू पत्ता लगाइन्छ, र शिखरको गठन समाधानमा NaOH एकाग्रतामा निर्भर देखिन्छ (नमूना 5-8, तालिका 3) (RRT = 0.79)।चित्र 5 ले NAOH को उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा दुई अटोक्लेभ नमूनाहरू देखाउँदै आयन क्रोमेटोग्रामको उदाहरण देखाउँछ।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी।
नोट: शीर्ष क्रोमेटोग्राम: नमूनालाई ०.१% NaOH जलीय घोल र अटोक्लेभ (२० मिनेटको लागि १२० डिग्री सेल्सियस) द्वारा उपचार गरिएको थियो।तल्लो क्रोमेटोग्राम: नमूनालाई NaOH सँग उपचार गरिएको थिएन, तर समान अवस्थाहरूमा अटोक्लेभ गरिएको थियो।203.30/129.10 Da (सकारात्मक MRM मोडमा) को सामूहिक रूपान्तरण LC-MS द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी।
सबै अटोक्लेभ नमूनाहरूमा, NaOH सँग वा बिना, BDDE एकाग्रता धेरै कम भयो (16.6 पटकसम्म) (नमूनाहरू 5-8, तालिका 2)।BDDE एकाग्रतामा कमी यस तथ्यको कारण हुन सक्छ कि उच्च तापक्रममा, पानीले BDDE को epoxide ring खोल्न 1,2-diol कम्पाउन्ड बनाउन आधार (न्यूक्लियोफाइल) को रूपमा काम गर्न सक्छ।यस कम्पाउन्डको मोनोइसोटोपिक गुणस्तर BDDE भन्दा फरक छ र त्यसैले प्रभावित हुनेछैन।LC-MS ले 203.30/129.10 Da को मास शिफ्ट पत्ता लगायो।
अन्तमा, यी प्रयोगहरूले देखाउँछन् कि नयाँ चुचुराहरूको उत्पादन BDDE, NAOH, र अटोक्लेभिङ प्रक्रियाको उपस्थितिमा निर्भर गर्दछ, तर HA सँग कुनै सरोकार छैन।
लगभग 2.71 मिनेट को एक अवधारण समयमा फेला परेको नयाँ शिखर त्यसपछि LC-MS द्वारा विशेषता थियो।यस उद्देश्यका लागि, BDDE (9.9 mg/mL) लाई 1% NaOH जलीय घोलमा इन्क्युबेटेड गरी अटोक्लेभ गरिएको थियो।तालिका ४ मा, नयाँ शिखरका विशेषताहरूलाई ज्ञात BDDE सन्दर्भ शिखरसँग तुलना गरिएको छ (अवधारण समय लगभग 3.47 मिनेट)।दुई चुचुराहरूको आयन खण्डीकरण विश्लेषणको आधारमा, यो निष्कर्षमा पुग्न सकिन्छ कि 2.72 मिनेटको अवधारण समय भएको शिखरले BDDE शिखरको रूपमा समान टुक्राहरू देखाउँदछ, तर फरक तीव्रताका साथ (चित्र 6)।2.72 मिनेटको अवधारण समय (PIS) सँग सम्बन्धित शिखरको लागि, 147 Da को द्रव्यमानमा खण्डीकरण पछि अझ तीव्र शिखर अवलोकन गरिएको थियो।यस निर्धारणमा प्रयोग गरिएको BDDE एकाग्रता (9.9 mg/mL) मा, पराबैंगनी स्पेक्ट्रममा विभिन्न अवशोषण मोडहरू (UV, λ=200 nm) पनि क्रोमेटोग्राफिक विभाजन (चित्र 7) पछि अवलोकन गरियो।2.71 मिनेट को अवधारण समय संग शिखर अझै 200 nm मा देखिने छ, जबकि BDDE शिखर क्रोमेटोग्राम मा समान परिस्थितिहरु मा अवलोकन गर्न सकिदैन।
तालिका 4 लगभग 2.71 मिनेटको अवधारण समय र 3.47 मिनेटको अवधारण समयको साथ BDDE शिखरको नयाँ शिखरको विशेषता परिणामहरू
नोट: यी नतिजाहरू प्राप्त गर्न, LC-MS र HPLC विश्लेषणहरू (MRM र PIS) दुई चोटीहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो।HPLC विश्लेषणको लागि, 200 nm को तरंग लम्बाइको साथ UV पत्ता लगाउने प्रयोग गरिन्छ।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;HPLC, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी;m/z, मास-टू-चार्ज अनुपात;PIS, उत्पादन आयन स्क्यानिङ;पराबैंगनी प्रकाश, पराबैंगनी प्रकाश।
नोट: मास टुक्राहरू LC-MS विश्लेषण (PIS) द्वारा प्राप्त गरिन्छ।शीर्ष क्रोमेटोग्राम: BDDE मानक नमूना टुक्राहरूको मास स्पेक्ट्रम।तल्लो क्रोमेटोग्राम: नयाँ शिखर पत्ता लगाइएको मास स्पेक्ट्रम (BDDE शिखरसँग सम्बन्धित RRT ०.७९ हो)।BDDE १% NaOH समाधानमा प्रशोधन गरिएको थियो र अटोक्लेभ गरिएको थियो।
संक्षिप्त रूपहरू: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ईथर;LC-MS, तरल क्रोमैटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, बहु प्रतिक्रिया निगरानी;PIS, उत्पादन आयन स्क्यान;RRT, सापेक्ष अवधारण समय।
चित्र 7 203.30 Da पूर्ववर्ती आयनको आयन क्रोमेटोग्राम, र (A) 2.71 मिनेटको अवधारण समयको साथ नयाँ शिखर र (B) 200 nm मा 3.46 मिनेटमा BDDE सन्दर्भ मानक शिखरको UV पत्ता लगाउने।
उत्पादन गरिएका सबै क्रस-लिङ्क गरिएका HA हाइड्रोजेलहरूमा, LC-MS परिमाणीकरण पछि अवशिष्ट BDDE एकाग्रता <2 ppm थियो, तर विश्लेषणमा नयाँ अज्ञात शिखर देखा पर्‍यो।यो नयाँ शिखर BDDE मानक उत्पादनसँग मेल खाँदैन।BDDE मानक उत्पादनले पनि सकारात्मक MRM मोडमा उही गुणस्तर रूपान्तरण (MRM रूपान्तरण 203.30/129.10 Da) विश्लेषण गरेको छ।सामान्यतया, क्रोमेटोग्राफी जस्ता अन्य विश्लेषणात्मक विधिहरू हाइड्रोजेलहरूमा BDDE पत्ता लगाउन सीमा परीक्षणको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, तर अधिकतम पत्ता लगाउने सीमा (LOD) 2 ppm भन्दा अलि कम हुन्छ।अर्कोतर्फ, अहिलेसम्म, NMR र MS क्रस-लिङ्किङ र/वा HA को परिमार्जनको डिग्रीलाई चिनी एकाइ टुक्राहरूमा क्रस-लिङ्क गरिएको HA उत्पादनहरूको विशेषता गर्न प्रयोग गरिएको छ।यी प्रविधिहरूको उद्देश्य हामीले यस लेखमा वर्णन गरेजस्तो कम सांद्रतामा अवशिष्ट BDDE पत्ता लगाउने मापन गर्न कहिल्यै भएको छैन (हाम्रो LC-MS विधिको LOD = 10 ppb)।